高分辨率熔解曲線(xiàn)（HRM）原理及應用(轉載)

　　高分辨率熔解曲線(xiàn)分析（high resolution melting analysis，HRM）的基本原理：雙鏈核苷酸（double strand DNA，dsDNA）的熱穩定性受其長(cháng)度和堿基組成的影響，序列變化會(huì )導致升溫過(guò)程中 dsDNA 解鏈行為的改變。

　　因為所用的熒光染料只能嵌入并結合到dsDNA 上，因此利用實(shí)時(shí) PCR 技術(shù)，通過(guò)實(shí)時(shí)檢測 dsDNA 熔解過(guò)程中熒光信號值的變化，就能以生成不同形狀熔解曲線(xiàn)的方式將 PCR 產(chǎn)物中存在的差異直觀(guān)地展示出來(lái)。

　　同時(shí)，借助于專(zhuān)業(yè)性的分析軟件就可以對測試群體實(shí)現基于不同形狀熔解曲線(xiàn)的基因分型或歸類(lèi)。

　　HRM原理：

　　在PCR反應前將新型DNA飽和熒光染料加入反應體系，然后將PCR產(chǎn)物直接導入高分辨熔解分析儀中，在一定的溫度范圍內將PCR擴增產(chǎn)物進(jìn)行加熱變性，儀器的光學(xué)檢測系統采集、分析熒光信號并繪制溫度熔解曲線(xiàn)，根據不同熔解曲線(xiàn)形狀來(lái)區分（單個(gè)）堿基差異。

　　最廣泛的 HRM 分析應用領(lǐng)域是基因篩查?；蚝Y查是搜索 PCR 擴增片段中是否存在未知變異，它可在測序步驟之前進(jìn)行或者作為替代測序方法。由于 PCR 產(chǎn)物突變可導致 DNA 熔解曲線(xiàn)的形狀改變，因此它可以利用 HRM分析檢測。雜交雙鏈 DNA 樣本擴增并熔解時(shí)，其熔解曲線(xiàn)不同于純合野生型或突變樣本。如果操作得當，可以減少至少95%的測序工作量。隨著(zhù)DNA染料和分析儀器的發(fā)展，HRM技術(shù)還將繼續完善和改進(jìn)，在遺傳病分子診斷領(lǐng)域發(fā)揮更多的作用。

　　HRM應用：

　　? 基因篩查 (突變研究)? 雜合性研究? 突變分析? 物種鑒定? 單核苷酸多態(tài)性 (SNP) 檢測? 甲基化分析

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　　發(fā)表文章實(shí)驗結果展示：

　　【1】Negrisolo, Susanna et al. “Could the interaction between LMX1B and PAX2 influence the severity of renal symptoms?”European Journal of Human Genetics26 (2018): 1708-1712.

　　使用Solis試劑盒，分析PAX2基因4號外顯子的錯義突變

　　【2】Gaczkowska, Agnieszka, et al. “Association of CDKAL1 Nucleotide Variants with the Risk of Non-Syndromic Cleft Lip with or without Cleft Palate.”Journal of Human Genetics, vol. 63, no. 4, 2018, pp. 397–406.

　　使用Solis試劑盒，分析CDKAL1基因SNP

　　HRM分析成功的關(guān)鍵：

　　1.保持較短的擴增片段，實(shí)現最高的靈敏度。與較大的擴增片段相比，100 bp 左右的擴增片段可簡(jiǎn)化單核苷酸熔解曲線(xiàn)的檢測。

　　2.確保 PCR 擴增片段的特異性。錯配產(chǎn)物和引物二聚體可使數據解釋復雜化。引物濃度低于 200nM，MgCl2 在 1.5 mM至3 mM 范圍及使用熱啟動(dòng)DNA 聚合酶將有助于獲得高特異性。

　　3.確保反應使用足夠的模板。一般而言，Ct 應低于30，以生成足夠的材料，實(shí)現準確的熔解分析。