高分辨率熔解曲線(xiàn)(HRM)原理及應用(轉載)
高分辨率熔解曲線(xiàn)分析(high resolution melting analysis,HRM)的基本原理:雙鏈核苷酸(double strand DNA,dsDNA)的熱穩定性受其長(cháng)度和堿基組成的影響,序列變化會(huì )導致升溫過(guò)程中 dsDNA 解鏈行為的改變。
因為所用的熒光染料只能嵌入并結合到dsDNA 上,因此利用實(shí)時(shí) PCR 技術(shù),通過(guò)實(shí)時(shí)檢測 dsDNA 熔解過(guò)程中熒光信號值的變化,就能以生成不同形狀熔解曲線(xiàn)的方式將 PCR 產(chǎn)物中存在的差異直觀(guān)地展示出來(lái)。
同時(shí),借助于專(zhuān)業(yè)性的分析軟件就可以對測試群體實(shí)現基于不同形狀熔解曲線(xiàn)的基因分型或歸類(lèi)。
HRM原理:
在PCR反應前將新型DNA飽和熒光染料加入反應體系,然后將PCR產(chǎn)物直接導入高分辨熔解分析儀中,在一定的溫度范圍內將PCR擴增產(chǎn)物進(jìn)行加熱變性,儀器的光學(xué)檢測系統采集、分析熒光信號并繪制溫度熔解曲線(xiàn),根據不同熔解曲線(xiàn)形狀來(lái)區分(單個(gè))堿基差異。
最廣泛的 HRM 分析應用領(lǐng)域是基因篩查?;蚝Y查是搜索 PCR 擴增片段中是否存在未知變異,它可在測序步驟之前進(jìn)行或者作為替代測序方法。由于 PCR 產(chǎn)物突變可導致 DNA 熔解曲線(xiàn)的形狀改變,因此它可以利用 HRM分析檢測。雜交雙鏈 DNA 樣本擴增并熔解時(shí),其熔解曲線(xiàn)不同于純合野生型或突變樣本。如果操作得當,可以減少至少95%的測序工作量。隨著(zhù)DNA染料和分析儀器的發(fā)展,HRM技術(shù)還將繼續完善和改進(jìn),在遺傳病分子診斷領(lǐng)域發(fā)揮更多的作用。
HRM應用:
? 基因篩查 (突變研究)? 雜合性研究? 突變分析? 物種鑒定? 單核苷酸多態(tài)性 (SNP) 檢測? 甲基化分析
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發(fā)表文章實(shí)驗結果展示:
【1】Negrisolo, Susanna et al. “Could the interaction between LMX1B and PAX2 influence the severity of renal symptoms?”European Journal of Human Genetics26 (2018): 1708-1712.
使用Solis試劑盒,分析PAX2基因4號外顯子的錯義突變
【2】Gaczkowska, Agnieszka, et al. “Association of CDKAL1 Nucleotide Variants with the Risk of Non-Syndromic Cleft Lip with or without Cleft Palate.”Journal of Human Genetics, vol. 63, no. 4, 2018, pp. 397–406.
使用Solis試劑盒,分析CDKAL1基因SNP
HRM分析成功的關(guān)鍵:
1.保持較短的擴增片段,實(shí)現最高的靈敏度。與較大的擴增片段相比,100 bp 左右的擴增片段可簡(jiǎn)化單核苷酸熔解曲線(xiàn)的檢測。
2.確保 PCR 擴增片段的特異性。錯配產(chǎn)物和引物二聚體可使數據解釋復雜化。引物濃度低于 200nM,MgCl2 在 1.5 mM至3 mM 范圍及使用熱啟動(dòng)DNA 聚合酶將有助于獲得高特異性。
3.確保反應使用足夠的模板。一般而言,Ct 應低于30,以生成足夠的材料,實(shí)現準確的熔解分析。