兩篇Nature：發(fā)現新型CRISPR剪刀Cas12a2，切割單鏈DNA，還能核酸檢測

作者：生物世界

撰文丨nagashi

編輯丨王多魚(yú)

排版丨水成文

在自然界中，細菌幾乎無(wú)處不在，人體也無(wú)時(shí)無(wú)刻不面臨細菌感染的威脅。但與人類(lèi)一樣，細菌也會(huì )受到病毒 （噬菌體） 的攻擊，為了應對病毒的侵襲，細菌也進(jìn)化出獨特的免疫防御系策略來(lái)對抗病原體，CRISPR系統就是其中之一。

在過(guò)去短短的十年時(shí)間里，基于CRISPR系統的基因編輯技術(shù)以極其驚人的速度迅猛發(fā)展，其工具種類(lèi)也愈漸繁多，并廣泛應用于基因編輯、基因治療、核酸定位及核酸檢測等領(lǐng)域，許多科學(xué)研究也因此發(fā)生了翻天覆地的變化。這也促使科學(xué)家們進(jìn)一步探索功能更多樣、應用更廣泛的CRISPR系統。

2023年1月4日，國際頂尖學(xué)術(shù)期刊 Nature 同期上線(xiàn)兩篇論文，詳細介紹了一款全新的CRISPR系統—— Cas12a2 。兩篇論文的共同通訊作者、猶他州立大學(xué)的 Ryan Jackson 教授指出， 此次新發(fā)現的核酸酶Cas12a2非常特殊，不僅與已知的Cas12a不同，其結構和功能與迄今發(fā)現的其他CRISPR系統都不一樣。

作為細菌的免疫防御系統，CRISPR系統能識別并精準切割特定的核酸片段，以此應對噬菌體或外來(lái)基因的侵襲。有趣的是，部分CRISPR系統除了能切割靶標核酸片段，還能隨機切割其他非靶標核酸片段。這種非特異性切割活性可能導致細菌的頓挫感染，即單個(gè)被病毒感染的細菌進(jìn)入休眠或死亡，從而防止病毒在整個(gè)細菌群體傳播。

此前，科學(xué)家們已經(jīng)發(fā)現Ⅴ型Cas12a、Cas12b和Ⅵ型Cas13a、Cas13b （CRISPR系統分為Ⅰ-Ⅵ型） 具有非特異性切割活性，其中Ⅴ型隨機切割單鏈DNA （ssDNA） ，Ⅵ型隨機切割單鏈RNA （ssRNA） 。

Cas12a2核酸酶在V型CRISPR-Cas系統中形成了一個(gè)獨特的分支

如今，這兩項發(fā)表在 Nature的研究表明，Cas12a2是一種更為特殊的CRISPR核酸酶，不僅在其結構上，更體現在功能上。當Cas12a2在gRNA的引導下識別侵入性RNA時(shí)，其核酸酶活性被激活，在切割靶標RNA的同時(shí)，還會(huì )同時(shí)降解細胞內的其他RNA和DNA，抑制細菌生長(cháng)并使其進(jìn)入休眠狀態(tài)，從而限制病毒的傳播擴散。

其中一篇論文的第一作者 Oleg Dmytrenko博士表示， 雖然這種非特異性切割活性已經(jīng)在其他CRISPR系統中發(fā)現，但是基于單個(gè)核酸酶識別入侵者并同時(shí)降解細胞中的其他RNA和DNA，還是首次發(fā)現。

Cas12a2的活性激活后，可同時(shí)降解細胞中的ssRNA、ssDNA和dsDNA，使得細菌進(jìn)入休眠狀態(tài)

不僅如此，研究團隊還對Cas12a2的結構和工作機制進(jìn)行了分析。研究人員利用高分辨率的冷凍電鏡 （cryo-EM） 技術(shù)，捕獲了Cas12a2與核酸分子結合時(shí)的復合物結構：Cas12a2在PFS序列的激活下識別并結合與gRNA互補的靶標RNA，然后Cas12a2會(huì )發(fā)生顯著(zhù)的構象變化，就像是彈簧刀被打開(kāi)一樣，其活性部位釋放出來(lái)，無(wú)差別切割周?chē)膯捂淩NA、單鏈DNA和雙鏈DNA。

Ryan Jackson教授表示， 令人難以置信的是，Cas12a2將通常筆直的雙螺旋DNA分子彎折90度，迫使DNA骨架進(jìn)入酶的活性部位，并在那里將其切斷。

Cas12a2的靶標RNA激活的非特異性切割活性的作用機制

更重要的是，與Ⅴ型和Ⅵ型CRISPR系統一樣，Cas12a2的非特異性切割活性也可以應用于核酸檢測。以2020年諾貝爾生理或醫學(xué)獎得主 Jennifer Doudna 及其團隊開(kāi)發(fā)的DETECTR診斷技術(shù)為例，其工作原理如下：

Cas12a在gRNA的引導下識別樣品中的靶標核酸序列，其非特異性切割活性被激活，并隨機切割溶液中的核酸探針。當用短波光照射樣本時(shí)，陽(yáng)性樣本會(huì )發(fā)出熒光，而陰性樣本則無(wú)熒光，從而判斷樣本中是否含有病毒核酸。

DETECTR檢測SARS-CoV-2的模式圖

由此看來(lái)，此次新發(fā)現的Cas12a2將為CRISPR診斷工具箱再增添一件極具潛力的新工具，未來(lái)或可用于開(kāi)發(fā)高靈敏診斷測試，以檢測各種新的病原體，如新冠病毒、流感病毒、埃博拉病毒和寨卡病毒等。

通過(guò)突變來(lái)改造Cas12a2

研究團隊還通過(guò)突變來(lái)改造Cas12a2，他們發(fā)現，單個(gè)氨基酸的突變可以使這種核酸酶在識別并結合靶標RNA之后只降解單鏈DNA，表明Cas12a2可以通過(guò)改造釋放其應用潛能。此外，與其他CRISPR系統一樣，Cas12a2在基因編輯領(lǐng)域也有良好的應用前景，有望成為新一代的基因治療工具。

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