是時(shí)候用這個(gè)熱點(diǎn)挽留一下腦門(mén)上的頭發(fā)了
撰寫(xiě)：生信大師姐 來(lái)源：小張聊科研平臺的“ i生信”*，*搜索“ i生信”即可關(guān)注/掃描關(guān)注見(jiàn)文末
#生信發(fā)文# #科研熱點(diǎn)# #APA#
掉了N根頭發(fā)才復現的科研熱點(diǎn)套路，被審稿人說(shuō)沒(méi)有創(chuàng )新性？？？
分析結果還熱乎著(zhù)呢，別人同樣的套路已經(jīng)見(jiàn)刊了？？？
復現難度較低的科研熱點(diǎn)套路，其實(shí)就是在拼手速，拼設計思路的手速、拼決定啟動(dòng)分析的手速、拼文章寫(xiě)作的手速，哪個(gè)環(huán)節掉鏈子都會(huì )輸掉比賽。
怎樣才能避免拼手速的時(shí)候輸掉比賽？？？怎么樣才能彎道超車(chē)？？？
APA（選擇性多聚腺苷化，Alternative polyadenylation）了解一下（背景知識詳見(jiàn)文末推薦閱讀），不同于以往僅關(guān)注表達量信息的分析模式，APA還可以從結構信息入手，驚不驚喜？？？意不意外？？？
APA相關(guān)的生信文章還非常非常少，所以作為生信發(fā)文的切入點(diǎn)的話(huà)，其創(chuàng )新性毋庸置疑。APA作為一個(gè)機制研究熱點(diǎn)，如何關(guān)聯(lián)到生信分析上？如何基于公共數據庫進(jìn)行生信分析？如何短平快的幫助咱們發(fā)文？這篇文章將給你答案。文章標題：Comprehensive Analysis of APA Events and Their Association With Tumor Microenvironment in Lung Adenocarcinoma（doi:10.3389/fgene.2021.645360）。
文末有彩蛋，不要走開(kāi)哦！
研究背景
因為預后較差且有效治療有限，肺腺癌（LUAD）的5年生存率很低，因此，闡明LUAD潛在的分子機制是必要的。70%的人類(lèi)基因含有多個(gè)polyA位點(diǎn)，這些位點(diǎn)產(chǎn)生多個(gè)不同長(cháng)度的3’UTR區域，從而促進(jìn)了轉錄組的多樣性。然而，在足夠大的隊列中深入分析LUAD的特定APA變化及其生物學(xué)或臨床意義仍有待確定。
研究方法
入組樣本及數據：公共數據庫中的數據—GSE40419（即Korea隊列）及TCGA Lung Adenocarcinoma (LUAD)（即TCGA隊列）。
關(guān)鍵分析方法：使用DaPars算法對RNA-seq數據進(jìn)行APA事件的識別。DaPars算法為每個(gè)樣本的給定基因生成一個(gè)PDUI評分（Percentage of Distal polyA site Usage Index），進(jìn)而量化樣本中該基因的poly(A)位點(diǎn)（PAS）使用情況。傾向于遠端PAS使用的基因(長(cháng)3 ' UTR)的PDUI得分接近1，而傾向于近端PAS使用的基因(短3 ' UTR)的PDUI得分接近0，最終得到一個(gè)包含每個(gè)樣本每個(gè)基因對應的PDUI信息的矩陣。
研究結果
Part1：LUAD中異常APA的綜合分析
通過(guò)比較癌和癌旁中的APA情況，作者發(fā)現腫瘤樣本中更傾向于出現短3 ' UTR的轉錄亞型。進(jìn)一步對APA變化的基因進(jìn)行富集分析發(fā)現，APA變化的基因在各種細胞膜系統相關(guān)term中顯著(zhù)富集，結果表明，APA可能參與調控膜蛋白的定位，這與APA衍生的3 ' UTR會(huì )影響mRNA和蛋白定位的研究背景是一致的。
編者按：數據處理過(guò)程及出圖，和常規表達譜分析是類(lèi)似的，唯一的區別是用來(lái)分析的數據不再是表達量信息，而是mRNA的結構信息，需要用特定的算法預處理一下。
Part2：APA介導miRNA結合位點(diǎn)的丟失
腫瘤發(fā)生過(guò)程中可以通過(guò)APA縮短3 ' UTR長(cháng)度進(jìn)而逃避miRNA的抑制，從而增加基因表達。作者進(jìn)一步探究了LUAD中由于3 ' UTR長(cháng)度縮短而丟失的miRNA結合位點(diǎn)的情況，結果發(fā)現70%左右的3 ' UTR長(cháng)度縮短事件會(huì )導致miRNA結合位點(diǎn)丟失。且腫瘤中3 ' UTR長(cháng)度縮短事件上的miRNA結合位點(diǎn)密度更大，這表明腫瘤細胞可能通過(guò)3 ' UTR長(cháng)度縮短緩解miRNA的結合。
為了探究3 ' UTR長(cháng)度縮短介導的miRNA結合位點(diǎn)丟失的影響，作者分析了癌和癌旁之間的差異表達基因，進(jìn)一步篩選在腫瘤中表達顯著(zhù)上調且3 ' UTR長(cháng)度縮短的基因，這些基因的高表達則可能是miRNA抑制逃逸的結果。然而，3 ' UTR長(cháng)度縮短的基因數在LUAD中并沒(méi)有明顯上調，這與之前對胰腺導管腺的分析一致，表明基因表達可能存在其他調控方式。
Part3：LUAD中的APA調控因子
為了探究在LUAD中APA的潛在調控因子，作者對APA相關(guān)調控基因進(jìn)行了表達水平及從基因組的角度探究了這些調控基因的表達變化機制。
編者按：這里相當于是對工具酶進(jìn)行了類(lèi)似基因家族的分析，而不是對APA結構信息進(jìn)行分析。
作者進(jìn)一步研究了APA事件與其調控因子在腫瘤中的表達相關(guān)性，作者將與超過(guò)一半APA事件有相關(guān)性的調控因子作為L(cháng)UAD中APA機制的主要失調因素，隨后發(fā)現CPSF2和CPEB3可能是LUAD APA的主要調控因子。有趣的是，CPSF2和CPEB3相關(guān)的APA事件中沒(méi)有共同的基因，且相關(guān)基因富集到不同的通路上，這表明這兩個(gè)基因可能獨立地調節LUAD的APA改變。
Part4：LUAD中的APA事件及其調控因子的預后價(jià)值
了解APA事件及其調控因子在LUAD中的廣泛變化可以為轉化醫學(xué)提供重要的見(jiàn)解，所以作者進(jìn)一步探究了與LUAD生存顯著(zhù)相關(guān)的APA事件及其調控因子。
Part5：基于A(yíng)PA調控因子探究LUAD的異質(zhì)性
為了探究APA調控因子的表達是否有助于LUAD的分層，作者基于根據APA調控因子的表達模式將TCGA隊列的LUAD樣本分成了四個(gè)亞型，并探究了四種亞型之間的差異，結果發(fā)現四種亞型在總生存期、3 ' UTR長(cháng)度、免疫細胞浸潤、缺氧、代謝等水平上存在顯著(zhù)差異。
寫(xiě)在最后
這篇文章的研究思路比較偏綜合分析，通過(guò)對數據進(jìn)行統計得出一定的結論。文章寫(xiě)作時(shí)對結果進(jìn)行描述及解釋即可，結果的陽(yáng)性率相當高，且不同研究角度之間屬于并行分析，整體分析風(fēng)險幾乎為0，堪稱(chēng)APA相關(guān)短平快思路的炸子雞。
文末彩蛋：
想知道這樣的生信結果如何作為基金前期或作為將來(lái)實(shí)驗課題的基礎嗎？
這里就簡(jiǎn)單和大家聊聊根據本文得出的結果和結論可以設計怎樣的簡(jiǎn)單實(shí)驗。
1. 選擇合適的APA調控因子作為研究對象
大家可能也發(fā)現了，這篇文章中對APA調控因子的篩選占較大篇幅，證據力度也更大，所以比較適合做為后續實(shí)驗設計的切入點(diǎn)。文中明確鎖定了CPSF2和CPEB3兩個(gè)調控因子，因此可以二者擇其一進(jìn)行后續實(shí)驗，也可以對這兩個(gè)因子同時(shí)展開(kāi)驗證（所謂多個(gè)選擇多條路），避免單一目標帶來(lái)的實(shí)驗風(fēng)險。
2. LUAD臨床樣本（不同亞型）檢測目標APA調控因子的表達
假設已經(jīng)選擇CPSF2和CPEB3同時(shí)進(jìn)行驗證，那么就需要基于本文中定義的LUAD亞型將樣本進(jìn)行分類(lèi)，并用RT-qPCR、免疫組化等方法在腫瘤樣本中檢測CPSF2和CPEB3的轉錄、蛋白水平表達量，以明確兩者與LUAD某種亞型的相關(guān)性。
3. 體外實(shí)驗驗證APA調控因子下游通路/表型
進(jìn)入到體外實(shí)驗部分，就需要在不同肺癌細胞系中通過(guò)敲除/敲減/過(guò)表達CPSF2或CPEB3，檢測文中富集到的通路或表型（TCA循環(huán)、糖酵解、缺氧通路等），以確定這兩個(gè)調控因子具體調控的是哪種通路，以及具體對應哪個(gè)表型。這也是建立APA調控因子與LUAD亞型因果關(guān)系的關(guān)鍵步驟。由于生信只能提供相關(guān)性信息，因此在實(shí)驗中，嘗試多個(gè)細胞系和多條通路是必要而且保險的選擇。
4. 明確APA調控因子直接靶點(diǎn)
生信和機制研究實(shí)驗的最大區別就是，機制研究要求有嚴格而明確的（一個(gè)或數個(gè)）靶點(diǎn)，以及嚴謹的科學(xué)驗證邏輯，以此支撐調控軸中分子間的上下游關(guān)系結論。
用人話(huà)說(shuō)就是，必須找到CPSF2或CPEB3直接結合的mRNA，并證明其對目標mRNA的APA影響和最終的調控方式。該步驟建議針對CPSF2或CPEB3蛋白使用RIP/RIP-seq實(shí)驗進(jìn)行靶向mRNA的篩選，再通過(guò)重復RIP/RNA-pull down/熒光素酶報告基因實(shí)驗來(lái)驗證獲得的結果。
所以你都學(xué)會(huì )（fei）了嗎？
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