Cell的自噬外泌體研究都怎么設計體內實(shí)驗？
撰寫(xiě)： 花博 來(lái)源：小張聊科研平臺的“ 課題指南針”*，*搜索“ 課題指南針”即可關(guān)注/掃描關(guān)注見(jiàn)文末
#國自然# #科研熱點(diǎn)# #課題思路#
不知道大家還記不記得我們上次給大家講解的這篇Cell（可能也已經(jīng)忘了）：
原文鏈接：
整體的思路是這樣的：
但是里面還是有不少小細節值得細品。上次給大家講了體外實(shí)驗驗證分子機制部分，這次再來(lái)分析分析剩下的研究?jì)热?。（忘了上次說(shuō)了什么，請戳：Cell文獻解讀丨囊括非經(jīng)典自噬、外泌體的頂刊非腫瘤研究思路（上））
番外：舉一反三，由C9ORF72亞型推及到大部分ALS
如果是別的期刊文章，體外實(shí)驗做到這里就差不多了。但是Cell的文章可不行。個(gè)例→普適才是真正的臨床意義之所在。ALS在患者中有許多不同的亞型，除了文中重點(diǎn)關(guān)注的C9ORF72型外，還有TDP-43突變型、FUS突變型以及未見(jiàn)已知ALS突變位點(diǎn)的散發(fā)型。
于是作者挑選了8例散發(fā)性（sALS）、TDP- 43G298S、兩例FUS突變型患者來(lái)源的細胞并進(jìn)行iMN誘導，重復之前的實(shí)驗，即對AP、ASO處理前后TDP-43的核/質(zhì)定位、神經(jīng)元死亡風(fēng)險率進(jìn)行了檢測，結果與之前體外實(shí)驗獲得的一致（A-G）。（詳見(jiàn)“Cell文獻解讀丨囊括非經(jīng)典自噬、外泌體的頂刊非腫瘤研究思路（上）”）
其次，為了檢測運動(dòng)神經(jīng)元的功能，作者還在果蠅體內對Pikfyve進(jìn)行RNAi干擾以及TDPG-43298S突變，并用AP處理后進(jìn)行幼蟲(chóng)翻轉實(shí)驗，結果證明降低Pikfyve和AP處理確實(shí)能提升或恢復運動(dòng)神經(jīng)元功能，由此完成異種體內實(shí)驗（H,I）。
體內實(shí)驗
大家可能也知道，高水平論文，尤其是頂刊級別中的動(dòng)物模型，通?；蚓庉嬓∈笫菢伺?，常見(jiàn)的基因編輯小鼠有Cre-Loxp系統和CRISPR/Cas9系統兩種，復雜的甚至還用到特殊品系，商品化基因編輯鼠進(jìn)行二次編輯，比如常見(jiàn)的人源化小鼠。
這篇Cell也不例外。文中體內實(shí)驗用到的小鼠有：
Pikfyve+/+：表達Pikfyve的純合小鼠
Pikfyve+/-：Pikfyve基因敲除雜合小鼠（Cre-Loxp系統）
Pikfyve ASO：Pikfyve反義寡核苷酸抑制小鼠
TDP-43 Tg/Tg：TDP-43轉基因小鼠（TAR4/4 Thy*::TDP-43）
AAV-(GR)*00：大腦皮質(zhì)細胞含GFP+/poly(GR)+的小鼠
當然還有作為對照的WT小鼠。
通過(guò)對這些小鼠的雜交，實(shí)現體內的功能挽救實(shí)驗。
*. 首先檢測對小鼠運動(dòng)功能的影響
不同功能挽救用以檢測的指標類(lèi)似：自噬標志物OPTN的表達、小鼠步態(tài)缺陷打分（行為學(xué)實(shí)驗）和小鼠生存期。
第一個(gè)功能挽救是在過(guò)表達TDP-43基礎上50%抑制Pikfyve（雜合突變）。結果表明抑制Pikfyve后小鼠運動(dòng)功能和生存期顯著(zhù)提升（A-C）。
第二個(gè)是過(guò)表達TDP-43基礎上通過(guò)ASO抑制Pikfyve，結果和上述類(lèi)似，就不贅述。還有一個(gè)處理是過(guò)表達TDP-43基礎上ASO抑制Pikfyve，再使用外泌體抑制劑GW48*9，于是表型回復到過(guò)表達TDP-43水平（D-G）。
最后通過(guò)AAV-(GR)*00構建的ASO疾病模型。同時(shí)使用ASO抑制Pikfyve，結果與之前一致，小鼠運動(dòng)功能和生存期都得到顯著(zhù)提高（H,I）。
2. 其次檢測對小鼠疾病病理和神經(jīng)再生的影響
回顧一下之前的結果，ALS神經(jīng)元主要的病理特征是pTDP-43在細胞質(zhì)中錯誤定位，形成斑點(diǎn)；而C9ORF72產(chǎn)生的poly(GR)+等也會(huì )異常聚集。因此，體內實(shí)驗同樣需要檢測類(lèi)似病理指標的情況。
使用免疫熒光染色就能清晰看到TDP-43過(guò)表達并ASO抑制Pikfyve，以及同時(shí)使用外泌體抑制劑后小鼠脊髓神經(jīng)元的形態(tài)，和TDP43的沉積情況（A-F）。
此外，神經(jīng)元分泌含pTDP-43蛋白的外泌體是否會(huì )被周?chē)毎麛z取，從而影響周?chē)毎δ芤彩莻€(gè)需要注意的問(wèn)題。因此檢測了小膠質(zhì)細胞中的pTDP-43斑點(diǎn)。結果顯示，TDP-43過(guò)表達+Pikfyve ASO小鼠的小膠質(zhì)細胞確實(shí)含有更多的pTDP-43斑點(diǎn)，但并未影響其形態(tài)和功能（G,H,I,J）。
為了觀(guān)察抑制Pikfyve更長(cháng)期的作用（因為神經(jīng)退行性疾病通常與年齡有關(guān)），作者還引入了TDP-43表達量較低的TAR4小鼠并與Pikfyve+/-小鼠雜交，獲得發(fā)病時(shí)間較晚的小鼠疾病模型。
同樣檢測pTDP-43相關(guān)指標，結果表明抑制Pikfyve也能減少斑點(diǎn)的積累，且大腹角神經(jīng)元數量回復。在A(yíng)AV-(GR)*00小鼠中獲得一致結果（K-P）。
總結
到這里整篇文章的主要內容就結束了。梳理一下，文章的亮點(diǎn)主要有以下幾處：
*. 小分子抑制劑的提前篩選，奠定重要的臨床意義；
2. 符合邏輯的多次篩選和錯誤選項排除避免套路化，呈現創(chuàng )新機制；
3. 多種基因編輯小鼠品系的構建為體內完整的功能挽救實(shí)驗創(chuàng )造條件；
4. 除了神經(jīng)元自身，還考慮到外泌體對周?chē)毎挠绊?，設計嚴謹。
本研究還缺些什么？
人無(wú)完人，研究論文也不可能盡善盡美。盡管本文的前期篩選基礎成熟，機制分析邏輯嚴謹，實(shí)驗設計全面，但仍然有一些“GAP”并沒(méi)有填上。最重要的一個(gè)問(wèn)題是：PIKFYVE抑制劑和驅動(dòng)自噬內含體形成之間的直接作用始終沒(méi)有闡明。
作者在文章開(kāi)頭就說(shuō)明了PIKFYVE的功能是將PI3P轉化為PI(3,5)P2（磷脂酰肌醇-3,5-二磷酸），且該物質(zhì)調控囊泡融合。然而，“囊泡融合”與“啟動(dòng)pTDP-43周?chē)纬勺允蓛群w”仍然不是一回事。pTDP-43究竟如何被識別？又是如何受到PI(3,5)P2的影響？這些部分可能還得留到今后被解答。
02*yin.com/s/l0dNjfR4RDjvOsftz_3zyQ
